«Найбільш визначальною рисою історії життя є постійне домінування бактерій»  

Стівен Джей Ґулд

Егоїстична агробактерія 

Напевно, багато хто помічав пухлинні утворення на корінні деяких рослин – корончаті галли. Вони є результатом життєдіяльності агробактерії – Agrobacterium tumefaciens. Це дрібний паличкоподібний ґрунтовий організм-патоген, який здатен генетично трансформувати рослину і підлаштувати її під свої потреби. Які ж потреби можуть бути в агробактерії? Як і в усіх живих організмів: їжа, безпечне місце для життя та розмноження. Для цього упродовж еволюції агробактерія «вирішила» не просто мирно співіснувати з рослинами, як це роблять її «родичі» – азотфіксуючі бактерії-симбіонти, а паразитувати на рослинах, ба більше – вказувати їм, що робити. Вона здатна вражати широкий спектр рослин, серед яких є виноград, хрін, цукровий буряк, горіхові та кістянкові (слива, вишня, черешня, абрикоса та інші).

Для задоволення власних егоїстичних потреб агробактерія потребує джерела енергії – опінів. Ці речовини є результатом конденсації кетокислот або амінокислот з цукрами. Це робить їх непоганим джерелом вуглецю та азоту. Самі по собі рослини не здатні синтезувати опіни, тому агробактерія змушує їх це робити. Для цього бактерія інфікує рослини, проникаючи всередину коріння, і генетично змінює метаболізм їхніх клітин, змушуючи утворювати пухлини та синтезувати опіни.

Мала та всесильна 

Однак що робить агробактерію такою всесильною над вищими рослинами? Вони здавалося б, в еволюційному плані набагато розвиненіші й складніші, та все ж «піддаються на провокації» цього егоїстичного мікроорганізму.

Варто почати з того, що малі розміри не завжди означають неповноцінність. Бактерія – одноклітинний живий організм, який, на відміну від багатоклітинних, має робити все цією самою однією клітиною: рухатись, харчуватись, розмножуватись тощо. Одна бактеріальна клітина фізично не зможе вмістити в собі багато елементів, зокрема забагато ДНК. Тому потрібно залишити лише необхідне і прибрати зайве сміття у вигляді інтронівІнтрони – це некодуючі послідовності в ланцюзі ДНК та РНК., псевдогенівПсевдогени – або «генетичне сміття» (Junk DNA) можна розглядати як нефункціональний аналог гену, який в процесі еволюції перестав експресуватися але досі присутній в геномі. тощо. Останні, як розкіш, можуть дозволити собі лише багатоклітинні організми. 

Генетичний матеріал агробактерії – це лінійна та кільцева хромосоми й дві кільцеві ДНК-плазмідиПлазміда – це дволанцюгова молекула ДНК, може бути кільцевої форми, характерна бактеріям. Для свого функціонування потребує наявності хромосоми. В одній клітині може бути як одна так і сотні плазмід.: At (Agrobacterium tumefaciens) та Ti (tumor inducing). Перша, як і хромосоми, містить гени, потрібні для підтримки життєдіяльності та нормального функціонування клітини. Друга несе гени, які відповідають за інфікування й генетичну трансформацію клітини рослини та зміну її метаболізму у потрібному для бактерії напрямку.

Отже, суперсила агробактерії полягає в наявності в неї Ті-плазміди. Вона містить трансферну ДНК (Т-ДНК), яка несе щонайменше 25 генів вірулентності (vir). Кожен з них бере активну участь у інфікуванні та трансформації рослинних клітин: продукти їхньої експресіїЕкспресія генів – процес, який призводить до синтезу РНК, а потім за участю РНК відбувається синтез білків. (білки та транскрипційні факториТранскрипційні фактори – сполуки білкової природи, які мають в своїй структурі спеціальні сайти зв’язування з ДНК. За рахунок своєї взаємодії з ДНК в певний час і певних її ділянках, здатні змінювати експресію генів.) регулюють роботу одне одного і забезпечують проникнення агробактерії в рослину.

Для активації роботи vir-генів потрібен зовнішній сигнал. Коріння рослин здатне виділяти сполуки фенольної природиФенольні сполуки (Феноли) – це клас хімічних речовин у яких гідроксильна група -ОН приєднана до ароматичного кільця (як-от резорцин, гідрохінон тощо)., особливо при подразненні. Шляхом хемотаксису агробактерія прямує до місця, де фенольний сигнал найвищий. В цей час у неї активуються гени вірулентності, і вона переходить у готовність інфікувати. 

Процес перенесення Т-ДНК в рослинну клітину відбувається за участі спеціальних бактеріальних утворів – Т-пілій. Близько 11 vir-генів відповідальні за їхнє формування. Після фенольного сигналу vir-гени починають експресуватися, далі йде синтез білків, які сформують Т-пілії. Білки транспортуються через цитоплазматичну мембрану агробактерії і прикріплюються до мембрани рослинної клітини, формуючи канал. В цей час Ті-плазміда розрізається продуктами експресії власних генів, і з замкнутого кільця переходить в лінійну форму. Лінійність значно полегшує та пришвидшує процес її переносу. Далі спеціальні vir-білки починають огортати розрізану Ті-плазміду та втягувати її у рослинну клітинну через канал Т-пілій. Коли агробактеріальна плазміда опиняється в клітині господаря, існує великий ризик її розрізання цитоплазматичними нуклеазами. Якби це сталось, агробактерія була би приречена самостійно здобувати собі їжу, а не змушувати рослину щось робити. Тому, vir-фактори щільно оточують Ті-плазміду і захищають її від агресивного середовища рослинної клітини.

Рослина клітина значно більша за агробактерію, і, аби зорієнтуватися, куди потрібно рухатися, Ті-плазміда містить спеціальний мотив ДНК, який розпізнається рослинними білками як сигнал, що її треба доставити в ядро клітини, що вони і роблять. Таким чином Ті-плазміда вже безперешкодно доставляється до ядра рослинної клітини. Там відбувається її інтеграція у геном. Перед цим Ті-плазміда вже в ядрі позбувається комплексу vir-білків, в цьому їй допомагає клітинна система утилізації білків самої рослини. Після цього відбувається розрізання ДНК рослини та вставка у неї Т-ДНК.

Після цього рослина починає експресувати привнесені гени опінів, які містяться в Т-ДНК. Т-ДНК несе також три гени, які залучені в процес синтезу фітогормонів, зокрема ауксину, індолацетатної кислоти та цитокініну ізопентеніл-аденозину. Понаднормова експресія генів веде до накопичення цих фітогормонів. В нормі вони регулюють ріст та розвиток рослин. Однак у випадку їх накопичення можливий неконтрольований поділ рослинних клітин, що веде до утворення пухлин – корончатих галлів. Таким чином, клітини рослин перестають виконувати свої функції і починають ділитись. Відповідно під час процесу поділу перенесена Т-ДНК потрапляє в дочірні клітини.

Різні штами агробактерії несуть різні гени опінів: нопалін, октопін, агропін тощо. Після трансформації у геномі рослини запускається експресія цих перенесених генів.  Відповідно, продукти їхньої експресії спричиняють утворення опінів із ресурсів клітини-господаря.

Зрештою, картина виглядає так: трансформовані рослинні клітини починають неконтрольовано ділитись, передавати Т-ДНК наступним поколінням клітин, і в кожній з них активно синтезуються опіни, які агробактерії використовують для свого живлення.

Як змусити агробактерію працювати на благо?

Уперше корончаті галли описав італійський біолог Марчелло Мальпігі у 1679 році. Однак природа цих рослинних пухлин була невідома до 1897 року. Фрідіанно Коваро, інший італійський біолог, першим повідомив про те, що причиною потворних утворів на рослинах є бактерія. Каваро зміг виділити агробактерії з корончатих галлів виноградної лози. Він показав: якщо виноградну лозу добре відмити від невідомого мікроорганізму, то вона перестає формувати пухлини. А якщо цим мікроорганізмом інфікувати здорову лозу, маємо корончаті галли. Так люди зрозуміли, що агробактерія є причиною пухлин у рослин, проте ніхто не знав, чому так відбувається.

У 1977 році Мері-Дель Чілтон виявила присутність чужинної ДНК в пухлинних клітинах рослин. Подальші дослідження показали, що чужинна Ті-плазміда присутня у рослинному ядрі.

У 1980-х роках з’ясувалося, що Ті-плазміда містить гени, які контролюють синтез рослинних фітогормонів та опінів. Врешті, у 1983 році Аллан Кеплан сформулював ідею щодо горизонтального переносу генів між агробактерією та рослинами. Це дало початок новій ері створення генетично-модифікованих рослин, в першу чергу господарського призначення. Це дозволило створити генетичні векторні конструкціїГенетичний вектор (векторна конструкція) – штучно створена молекула нуклеїнової кислоти (в основному ДНК), яка використовується в генетичній інженерії для передачі цільового гену-інтересу (наприклад, стійкості рослин до гербіцидів) до потрібного організму. на основі Ті-плазміди. Вони інтегруються у агробактерію, а потім вона трансформує рослину за природним для неї механізмом. Генетичні конструкції несуть гени, які нам потрібні: стійкості до патогенів, комах, гербіцидів тощо.

На сьогодні існує великий перелік генетично модифікованих рослин. Золотий рис містить високу концентрацію вітаміну А. Завдяки людині та агробактерії кукурудза стала стійкою до комах-шкідників, а папая врятована від вірусів. Вже згаданий томат довго не псувався, а пшениця змогла бути стійкою до гербіцидів.

Сьогодні можливості генетичної інженерії просто вражають. Окрім створення ГМО, тепер можна здійснювати редагування генів за допомогою технології CRISPR-Cas9. Це все відкриває величезні перспективи для створення нових сортів рослин, які зможуть краще задовольнити потреби людства в умовах зростання популяції та кліматичних змін. Навіть лікування хвороб стає реальнішим. Це все стало можливим завдяки хитрій та егоїстичній агробактерії, яка у руках людини стала зручним інструментом для створення ГМО.

• 1. — Abel P.P. l, Nelson R.S., De B., Hoffmann N., Rogers S. G., Fraley R.T. and Beachy R. N. Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene // Science. – 1986. – Vol. 232(4751). – P.: 738-43. DOI: 10.1126/science.3457472
• 2. — Horsch R. B. et al. Inheritance of functional foreign genes in plants // Science. — 1984. — V. 223. — P.: 496—498.
• 3. — Stanton B. Gelvin. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the “Gene-Jockeying” Tool // Microbiology and molecular biology reviews. – 2003. P. 16–37 DOI: 10.1128/MMBR.67.1.16–37.2003
• 4. — Karami O., Esna-Ashari M., Karimi Kurdistani G. and Aghavaisi B. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: the role of host // BIOLOGIA PLANTARUM. – 2009. – Vol. 53 (2). – P. 201-212.
• 5. — Klee H., Horsch R., and Rogers S. Agrobacterium-mediated plant transformation and its further applications to plant biology // Ann. Rev. Plant Physiol. - 1987. – Vol. 38. – P.: 467-86.
• 6. — Hwang HH, Yua M., and Lai E-M. Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications // The Arabidopsis Book, 2017(15). doi: 10.1199/tab.0186
• 7. — Clarence I. Kado Historical account on gaining insights on the mechanism of crown gall tumorigenesis induced by Agrobacterium tumefaciens // Front. Microbiol., - 2014. - Vol 5. DOI:10.3389/fmicb.2014.00340