ОСТАННІЙ ПОДКАСТ
Підписуйся на найнауковішу розсилку!
І отримуй щотижневі новини науки і технологій

    Ми під'їдаємо крихти cookies за вами. Навіщо це нам?

    Читати

    Пардон за відволікалочку. Допоможи Куншт бути незалежним!

    Пардон за відволікалочку. Допоможи Куншт бути незалежним!

    Повідомлення успішно надіслано

    Для пошуку
    введіть назву запису
    Біологія — 07.07.19
    ТЕКСТ: Віра Єфремова
    Фото: Віра Єфремова
    Ми любимо тексти без помилок. Якщо ви все ж таки щось знайшли, виділіть фрагмент і натисніть
    Ctrl+Enter.
    Органоїдний хайп

    Ще не орган, але вже значно більше, ніж просто набір клітин: впродовж останніх кількох років у науковій спільноті багато галасу здіймається навколо органоїдів. Щоб зрозуміти, чому ці крихітки наробили стільки лементу, необхідно знати, чим органоїди кращі за попередні, перевірені роками, методи культивування клітин.

    Що в імені твоєму?

     

    Зірковий час можуть мати не тільки публічні особи, як-от політики, актори чи громадські діячі, а й окремі наукові методи, за допомогою яких здійснюється революція в науці і досягаються небачені досі результати. Свій шлях до успіху та завоювання дослідницьких лабораторій по всьому світу органоїди – тривимірні культури клітин, які імітують органи в зменшеному масштабі – почали у 2008 році. Вже у 2013 цей метод культивування клітин був названий «найбільшим науковим проривом року» за версією видання The Scientist, а у 2017 році метод вирощування органоїдів був названий «методом року» за версією одного із найвпливовіших наукових видань світу – журналу Naturе. Якщо скористатися пошуком у одній з найбільших баз даних наукової літератури світу PubMed, то побачимо, що слово «organoid» у 2012 році у своїй назві мали 74 статті, а в червні поточного року – 610 різноманітних робіт. Якщо ж звузити пошук до якогось конкретного типу органоїдів, наприклад, «brain organoid», то результати будуть ще більш вражаючими: всього дві статті у 2012 та 82 станом на червень 2019 року. 

     

    Історія органоїдів як нового методу почалася із культивування клітин шлунково-кишкового тракту у вигляді 3D-культур. Наразі органоїди застосовуються у багатьох напрямках досліджень: існують «легеневі», «підшлункові», «печінкові» та навіть «судинні» органоїди. Проте справжній ажіотаж цей метод культивування клітин спричинив, коли його почали застосовувати у нейробіології – науці, що вивчає нервову систему.

     

     

    Міні-мозок у чашці Петрі: вигадка, перебільшення чи реальність?

     

    Розвиток мозку – це дуже чутливий та складно керований процес, який потребує чіткого контролю у часі та просторі. Усі механізми, що до цього залучені, мають бути досконало узгодженими, як звучання музичних інструментів у оркестрі. Саме така синергія необхідна для того, щоб у підсумку всі структури новоствореного мозку відповідали своєму функційному навантаженню, забезпечуючи виконання відповідних завдань.

     

    Як часто люблять жартувати нейробіологи, мозок – це найскладніший і найважливіший орган у тілі людини, за версією самого мозку. Фізик і футурист доктор Мічіо Кайку в своїй книзі «Майбутнє розуму» (англ. – «The Future of the Mind») написав про мозок так: «Галактика Чумацький шлях налічує 100 мільярдів зірок; приблизно стільки ж нейронів у людському мозку. Ми мусили б подолати відстань у двадцять чотири трильйони миль до першої зірки поза межами Сонячної системи, щоб знайти настільки ж складний об’єкт, як той, що носимо на плечах»1. Саме тому зусилля багатьох вчених зосереджені на тому, щоб краще зрозуміти, як саме розвивається мозок та що відбувається, якщо якась зі скрипок у цьому оркестрі починає фальшивити, виконуючи цю найскладнішу та найдивовижнішу симфонію.

     

    З огляду на складність та багаторівневість процесу розвитку головного мозку людини, дослідження пов’язані із ним потребують моделей, що якомога точніше відтворюватимуть певні етапи та зміни, які вібуваються з ним під час ембріонального розвитку. Але головна складність у створенні таких моделей полягає у тому, що вчені намагаються відтворити щось, чого ще до кінця не розуміють, тому часом це нагадує пошуки чорної кішки у темній кімнаті. Широка популярність органоїдів зумовлена насамперед тим, що вони здатні принаймні трохи «освітлити» цю темну кімнату.

    Фото 1: Органоїди кори передньго відділу головного мозку генеровані з індукованих стовбурових клітин людини, після двох місяців культивування.

    Методи генерування мозкових органоїдів значно вдосконалилися протягом останніх 3-5 років, проте всі вони базуються на природній здатності стовбурових клітин до самоорганізації. Ця здатність закодована в ДНК клітин2, і тому, якщо суспензію із окремих стовбурових клітин помістити у спеціальну пластикову чашу, то всього за кілька годин ці клітини утворять зв’язки, сформувавши ембріональне тіло (утворення зі стовбурових клітин сферичної форми). Протягом подальшого культивування у рідинне середовище, в якому розвивається органоїд, необхідно буде додати певні фактори росту, які спрямують органоїд до формування саме клітин мозку, а не печінки чи нирки, наприклад. Все починається з малого, так само і органоїд, що на початку був лише ембріональним тілом із 6000-10000 клітин, розвивається та формує досить складну структуру із різноманітних клітин мозку (прогеніторних стовбурових клітин та різних типів нейронів), які після двох місяців культивування мають близько 2 мм у діаметрі (Фото 1), а після чотирьох місяців – близько 2,5 мм (Фото 2). Для того, щоб дізнатися, який саме набір клітин утворює певний органоїд, цю 3D-культуру необхідно піддати фіксації у формальдегіді, потім заморозити у суміші 100% етилового спирту та сухого льоду, виготовити дуже тонкі зрізи тканини (товщиною 20 мікрометрів) та забарвити їх за допомогою різноманітних маркерів, специфічних для певного типу клітин. 

    Фото 2: Органоїди кори передньго відділу головного мозку генеровані з індукованих стовбурових клітин людини, після чотирьох місяців культивування.

    Протягом третього тижня культивування у мозковому органоїді, що репрезентує кору переднього відділу мозку людини, більшість клітин повинна продукувати Sox2 (маркер нервових стовбурових клітин) і вже мають починати з’являтися поодинокі клітини, позитивні на бета-3-тубулін, що є маркером новоутворених нейронів (Фото 3). Після п’яти тижнів культивування репертуар клітин органоїда кори головного мозку дещо змінюється: кількість новоутворених нейронів збільшується, і вони починають продукувати маркери, притаманні дозрілим нейронам, такі як МАР2. І хоча кількість нейронів збільшується, проте пул клітин-попередниць досі дуже обширний, тому більшість цих клітин продукують один із типових маркерів нервових стовбурових клітин – Nestin, – до того ж, значна кількість цих клітин також позитивна на Кі67 (маркер, що є індикатором того, що клітини продовжують активно ділитися). Усі ці маркери є типовими для раннього етапу розвитку кори головного мозку.

    Фото 3: Органоїди кори передньго відділу головного мозку генеровані з індукованих стовбурових клітин людини. 20 днів культивування, забарвлені Sox2 (червоний, маркер прогеніторних нервових клітин), ßIIITub (зелений, маркер новоутворених незрілих постмітотичних нейронів), DAPI (синій, маркер клітинного ядра). Масштаб 50 мікрометрів.

    Численні наукові дослідження з використанням мозкових органоїдів показали, що вони здатні відтворювати певні аспекти розвитку головного мозку людини, особливо на ранніх етапах цього процесу, зокрема наявність у органоїдах специфічних для людини типів клітин, що відіграють дуже важливу роль під час розвитку кори головного мозку і є відсутніми у представників інших видів тварин. Така здатність органоїдів до точного відтворення певних фрагментів розвитку головного мозку робить їх чудовим матеріалом для вивчення як фундаментальних питань розвитку мозку, так і дослідження механізмів виникнення певних захворювань.

     

    Одним із прикладів застосування мозкових органоїдів для вивчення механізму захворювання розвитку головного мозку є моделювання синдрому Міллера-Дікера3. Синдром Міллера-Дікера – це захворювання, спричинене мутацією генів в одній із ділянок 17-ї пари хромосом. Як наслідок, порушується структура кори головного мозку, і у людей з цим синдромом майже повністю відсутні звивини, що спричиняє значну затримку в інтелектуальному розвитку, порушення певних рефлексів та появу епілептичних нападів. Більшість досліджень цього захворювання раніше проводили на гризунах, проте проблемою є те, що поверхня мозку у мишей – гладенька, тобто за абсолютно нормальних фізіологічних умов у них відсутні звивини. Саме тому необхідно було створити таку модель цього захворювання, яка була б максимально наближеною до тканини мозку людини. 

     

    Тому головним завданням дослідницького проекту Рейнського університету імені Фрідріха Вільгельма в Бонні було згенерувати індуковані стовбурові клітини (англ. – «іPS cells»). Індуковані стовбурові клітини – це новий тип стовбурових клітин, що викликає значний інтерес у лікарів і вчених. За їхнє відкриття Шинья Яманака отримав Нобелівську премію у 2012 році. Причина такої популярності зумовлена тим, що індуковані стовбурові клітини мають майже всі властивості ембріональних стовбурових клітин, але походять не з ембріона, а із тканин дорослої людини. Таким чином, використання цих клітин не породжує етичних проблем, що зазвичай виникають під час використання ембріональних стовбурових клітин. 

     

    Після успішного генерування індукованих стовбурових клітин їх використали для формування 3D-культур зі здорових (контрольних) клітин та клітин пацієнтів із цим захворюванням. Коли цього досягли, стало можливо детально дослідити розвиток патологічних змін у органоїдах, що походять із клітин пацієнтів, порівнюючи їх з контрольними органоїдами. Це дозволило відкрити частину механізму розвитку патології, спричиненої синдромом Міллера-Дікера. Було доведено, що зміни у структурі мозку людей, що мають цей синдром, спричинені не лише відхиленнями у процесі міграції новоутворених нейронів, як вважалося раніше. Причина – у поєднанні проблем, пов’язаних із формуванням ніші стовбурових клітин під час розвитку головного мозку. Усю цю інформацію неможливо було б отримати ні за рахунок культивування клітин в 2D, що ростуть на поверхні чаші для адгезивної культури клітин, ні за рахунок використання тварин з відповідним генетичним пошкодженням.

     

    У 2016 році також було продемонстровано, що за допомогою використання органоїдів можна досліджувати не тільки проблеми розвитку мозку, що спричинені різноманітними генетичними мутаціями, а й патології, що розвинулися як наслідок вірусного інфікування. Прикладом таких досліджень є вивчення ефекту інфікування вірусом Зіка (спалах якого припав саме на 2015-2016 роки)4. Органоїди, інфіковані вірусом, були значно меншого розміру, ніж нормальні, як і мозок дітей, що були уражені вірусом під час ембріонального розвитку. Завдяки дослідженню було встановлено, які саме клітини в мозку, що розвивається, найбільш вразливі до цього вірусу. Це може стати важливим кроком у подальшому вивченні ефектів інфікуванням цим вірусом, а також у розробці фармакологічної терапії для подолання його наслідків.

     

     

    Виклик прийнято!

     

    Незважаючи на всі переваги використання органоїдів, для дослідження фізіологічного розвитку мозку та перебігу різноманітних захворювань, пов’язаних із цим процесом, органоїди, як і будь-яка інша модель, мають певні обмеження. Наприклад, органоїди дуже варіабельні, тобто неможливо знайти навіть два абсолютно ідентичні органоїди, що ускладнює їхнє використання для розробки нових ліків, де ідентичність об’єктів дослідження та ефектів певних фармакологічних елементів є критичною для отримання достовірних результатів.

     

    Ще одним обмеженням цього методу є те, що їх досить складно культивувати довше за рік, оскільки у них відсутні кровоносні судини, що під час нормального розвитку в тілі людини транспортують кисень та поживні речовини до мозку. Також дуже складно згенерувати органоїд, частини якого репрезентують різні ділянки мозку людини, оскільки вчені ще не до кінця зрозуміли усі сигнальні шляхи та способи їхньої взаємодії під час одночасного розвитку різних відділів мозку у процесі ембріогенезу. 

     

    І нарешті, дуже складно аналізувати функційну активність нейронів, що утворені всередині органоїда, а саме функційні характеристики нейронів (їхню здатність генерувати й передавати електричні імпульси) є одними з найважливіших аспектів формування та злагодженої роботи мозку. Проте методики культивування 3D-культур так блискавично розвиваються, що майже щомісяця публікується нове дослідження. Це значно покращує наявні методи та розширює знання про нормальний та патологічний розвиток мозку людини. 

     

    Наприклад, варіабельність органоїдів можна зменшити, якщо частково автоматизувати процес їхньої генерації. Проблему із недостатньою кількістю кисню та поживних речовин через відсутність кровоносних судин можна вирішити кількома шляхами. По-перше, пересадити органоїди до мозку піддослідної тварини5, і в такому випадку клітини органоїда будуть живитися завдяки кровоносним судинам у мозку тварини, до якої вони будуть трансплантовані; по-друге, можливо буде використати органоїди кровоносних судин і поєднати їх із будь-яким типом мозкових органоїдів. Неможливість ефективного виготовлення органоїдів, ділянки яких відповідають різним частинам мозку, можна подолати шляхом «злиття» двох органоїдів, що репрезентують різні ділянки мозку. Зa допомогою цього «злиття» можна, наприклад, детально дослідити процеси «гальмування» у нейрональних мережах, а саме з порушеннями у генерації, міграції чи інтеграції цього класу нейронів пов’язано багато патологій, що спричиняють різноманітні розлади аутичного спектру6. Вивчення міграції та функціонування інтернейронів допоможе у розумінні та лікуванні багатьох порушень роботи мозку, оскільки саме цей тип нейронів здатен вибірково знижувати активність частини сигналів у корі головного мозку, таким чином дозволяючи мозку сфокусуватися на виконанні певного завдання, не відволікаючись на непотрібні стимули. Два місяці тому була опублікована блискуча стаття, в якій було продемонстровано, що нейрони, які сформувалися у 3D-культурі, функційно активні й здатні викликати м’язові скорочення, що доводить: вони не тільки відображають структуру, а й можуть виконувати притаманні реальним клітинам мозку функції7

     

    Усі перераховані вдосконалення методів культивування органоїдів були досягнені всього за останні 2-3 роки, тому попереду ще дуже багато захопливих та важливих відкриттів.     

    ТЕКСТ: Віра Єфремова
    Фото: Віра Єфремова
    Статті
    Промо
    Проєкт інтелект. Воєнний сезон. Епізод 5: NFT та Україна

    Чи можна написати «Проєкт інтелект» на гривні й продати за мільйони доларів як NFT?

    Людина
    Від батька до сина: що таке генеалогія і як досліджувати свій рід

    Що таке ДНК-генеалогія і як далеко кожний з нас може просунутися у вивченні свого роду?

    Наука
    Екологічно чиста отрута: уривок з книжки «Зоологічна екскурсія супермаркетом»

    Чому краще утриматися від «дикого» промислу морепродуктів, особливо у водоймах, де цвіте вода?

    Наука
    Передумови приходу диктаторів до влади: Італія, Німеччина, РФ

    Що стало передумовами приходу диктаторів до влади на прикладі фашистської Італії, нацистської Німеччини та путінської росії? Розповідає співавтор і ведучий каналу «Історія Без Міфів» Владлен Мараєв.

    Людина
    Як кожен з нас може подякувати військовим і допомогти їм з адаптацією

    Як змінюється світосприйняття військових і що ми можемо зробити, аби висловити їм вдячність і допомогти в адаптації до мирного життя?

    Біологія
    Не тільки в історії. Який слід залишить війна в наших генах

    Як війни, голод та важкі психологічні травми залишають слід у геномі людини й чи можемо ми на це якось повпливати?